选对内参蛋白，实验成功一半！生物小白必看指南

还在为免疫蛋白印迹（Western Blot，WB）条带深浅不一抓狂吗？实验结果总像开盲盒？问题很可能出在内参蛋白没选对！别担心，这篇指南专为实验萌新打造，手把手教你选对内参，让数据稳如泰山！

1. 内参蛋白是什么？为什么它如此重要？

想象一下：你想测量两杯水的多少，但每次倒水的杯子大小都不一样（有时用大杯，有时用小杯），这样比较还有意义吗？当然没有！内参蛋白就是实验中的“标准杯”。它是在你的实验条件下（比如药物处理、基因敲除等），表达量稳定不变的“看家蛋白”。

它的核心作用：

1) 校正上样量：确保你每次加到胶孔里的蛋白总量是一致的。

2) 校正操作误差：弥补实验过程中转膜、显影等步骤带来的微小差异。

3) 量化目标蛋白：只有把目标蛋白的信号与内参蛋白的信号进行比较（比如计算比值），得到的相对表达量变化才真实可靠！

简单说：没有可靠的内参，你的实验结果可信度大打折扣！

2. 如何选择“靠谱”的内参蛋白？（小白速成四步法）

第一步：确定你的实验样本类型，不同的样本，其“看家”蛋白可能完全不同！

动物细胞/组织，最常见的选择有：

1) β-Actin(肌动蛋白，42KDa)：广泛分布于细胞浆内，表达量丰富，占细胞总蛋白的50%，应用最广，但注意！在高增殖/代谢活跃的细胞（如癌细胞、肌肉细胞）或涉及细胞骨架变化的实验中，它可能不稳定！

2) GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，37KDa)：糖酵解关键酶，在所有组织细胞中高表达，表达量基本恒定。但涉及代谢（如糖、氧水平改变）、高增殖细胞的实验要小心，它也可能变！

3) Tubulin(微管蛋白，50KDa)：α-Tubulin,β-Tubulin。作为细胞骨架蛋白，表达稳定，常用于免疫荧光观察细胞的微管结构。同样要注意细胞骨架动态变化的实验。

4) 其他可靠选择：Vinculin, COX IV (线粒体标记), Lamin B1 (核膜蛋白), Histone H3(组蛋白-核内蛋白)。当上述常用内参不稳定时，这些是很好的备选。

植物样本：动物常用的内参在植物里往往不适用！

1) Rubisco(大亚基)：光合作用关键酶，在绿叶组织中非常丰富稳定。

2) Actin(植物肌动蛋白)：类似动物Actin，但需使用植物特异性抗体。

3) Tubulin(植物微管蛋白)：类似动物Tubulin。

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4) 其他：Ubiquitin,EF-1α(延伸因子)。

细菌样本：动物/植物内参基本无效！

1) RNA聚合酶亚基(如RpoB/RpoC)：常用且稳定。

2) Gyrase(如GyrB)：DNA解旋酶亚基。

3) EF-Tu(延伸因子)：参与蛋白质合成。

特定亚细胞结构：如果你研究的是线粒体、细胞核、细胞膜等特定部位的蛋白，需要选择该部位特异性的内参！

1) 线粒体：COX IV, VDAC1, SDHA。

2) 细胞核：Lamin A/C, Lamin B1, Histone H3, PCNA (注意增殖状态)。

3) 细胞膜：Na⁺/K⁺ ATPase。

4) 细胞浆：GAPDH, β-Actin, Tubulin (但需确认目标蛋白是否也在胞浆)。

第二步：查阅文献！查阅文献！查阅文献！

重要的事情说三遍！这是最快捷、最可靠的方法。

怎么做？在PubMed、Google Scholar等数据库搜索：

1) 你的研究领域/疾病+你的目标蛋白 + AND western blot

2) 你的细胞类型/组织类型 + housekeeping protein

3) 你的细胞类型/组织类型 + loading control

看什么？看看和你做类似研究、用类似样本的大佬们，他们用的是什么内参？通常选择被广泛使用和验证的内参会更保险。

第三步：考虑你的实验处理因素

你的实验操作会不会影响内参蛋白？

1) 例如：研究代谢疾病或能量应激？GAPDH可能不稳定！

2) 例如：研究细胞周期或细胞迁移？β-Actin、Tubulin可能受影响！

3) 例如：研究药物处理？要确保药物不会影响你选的内参的表达！

4) 黄金法则：理想的内参蛋白应该完全不受你的实验处理影响！

第四步：验证！验证！再验证！

选定了内参蛋白后，绝对不能直接默认它在你的实验条件下是稳定的！

怎么做验证？

1) 在你的实验体系中（例如，对照组vs.处理组），同时跑目标蛋白和候选内参蛋白。

2) 比较不同组之间内参蛋白条带的信号强度。

3) 理想情况：各组的条带亮度应该非常接近，条带粗细均匀一致。

4) 可以用软件分析灰度值，看组间差异是否显著（正常情况下应该不显著）。

如果内参不稳定怎么办？回到第二步和第三步，尝试其他候选内参蛋白，直到找到一个在你的实验条件下真正稳定的为止。有时需要尝试2-3个才能找到最合适的。

3. 选择内参蛋白的实用小贴士

分子量差异：确保你选的内参蛋白的分子量与你研究的目标蛋白分子量有明显差异，分子量最好相差5kd以上。这样在PVDF/NC膜上，不会因为条带重叠从而影响结果判读和定量。（例如：目标蛋白50kDa，选个40kDa或70kDa的内参就比选个48-52kDa的好）。

抗体质量：购买经过验证、口碑好的内参蛋白抗体。劣质抗体是实验失败的常见元凶！因此购买抗体钱应查看供应商提供的验证数据（如不同细胞系/组织中的特异性条带图）。

组织样本特殊性：全组织提取物成分复杂。例如肌肉组织中肌动蛋白含量极高，可能需要选择其他内参（如GAPDH、Vinculin）。脂肪组织、脑组织等也有其特殊性，要查文献。

考虑表达丰度：内参蛋白在样本中应该有足够高的表达量，能产生清晰、易检测的信号。表达量太低的内参，信号弱且不稳定，不适合做参照。

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